重组DNA筛选办法有多种,以下为你详细介绍。
第一是遗传学筛选法。抗生素抗性筛选是常见的一种,载体上一般带有抗生素抗性基因,如氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因等。将重组DNA导入宿主细胞后,把细胞接种在含有相应抗生素的培养基上,只有含有载体的细胞才能成长,由于载体上的抗性基因赋予了细胞对抗生素的抵抗能力。还有插入失活筛选,譬如载体上有两个抗性基因,当外源DNA插入其中一个抗性基因时,该基因失活。通过在含不同抗生素的培养基上培养,依据细胞的成长状况来判断是不是有外源DNA插入。
第二是核酸杂交筛选法。包含原位杂交,它是将转化细胞或噬菌体吸附在硝酸纤维素膜或棉纶膜上,经过裂解、变性等处置使DNA固定在膜上,然后用标记的核酸探针与膜上的DNA杂交,通过放射自显影或其他测试办法找出含有目的DNA的菌落或噬菌斑。Southern印迹杂交也是常见的办法,它先将DNA进行酶切、电泳离别,再将DNA从凝胶转移到膜上,与标记的探针杂交,可用于测试重组DNA分子中是不是含有目的基因及基因的大小等信息。
再者是PCR筛选法。依据目的基因的序列设计特异性引物,以转化细胞的DNA为模板进行PCR扩增。假如扩增出预期大小的片段,则说明细胞中含有目的基因。这种办法迅速、灵敏,可以在短期内筛选很多样品。
另外还有免疫学筛选法。当目的基因可以表达出相应的蛋白质时,可以借助抗原 | 抗体反应来筛选。将转化细胞裂解,把裂解液点样在硝酸纤维素膜上,然后加入特异性抗体,通过显色反应或其他测试方法找出含有目的蛋白的菌落。
最后是酶切鉴别筛选法。从筛选出的阳性克隆中提取重组DNA,用适合的限制性内切酶进行酶切,然后通过电泳剖析酶切产物的大小和数目,与预期的结果进行比较,以确定重组DNA是不是正确构建。
这类筛选办法各有优势和弊端,在实质应用中,常常会结合多种办法来提升筛选的准确性和效率。
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